570 Biowissenschaften, Biologie
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Development of strategies for the derepression of carbon catabolite repression in Aspergillus niger
(2024)
Carbon catabolite repression (CCR) is a crucial regulatory mechanism facilitating the preferential utilization of the most favorable carbon source in the environment, and is mediated by a key regulator, CreA, in most fungi. The ascomycete Aspergillus niger (A. niger) is of particular in-terest for biotechnological applications due to its natural ability to secrete carbohydrate-active enzymes (CAZymes) targeting plant biomass. The presence of easily metabolizable sugars such as glucose, which accumulate during the bioconversion of plant biomass, results in the repres-sion of CAZymes-encoding genes through CreA-mediated CCR. Consequently, CCR poses an economic challenge when easily metabolizable monosaccharides are present in the substrate. For this purpose, metabolic engineering strategies targeting CreA are employed to minimize the im-pact of CCR and enhance the enzymatic productivity of A. niger. Applying these strategies often results in reduced CreA-mediated CCR on one hand, but also lead to phenotypic side effects, including impaired growth and sporulation on the other hand. This study establishes that the conserved region (consv) is primarily responsible for the repressive properties of CreA, as the consv deletion of CreA leads to the strongest CC derepression of a luciferase CCR reporter compared to strains with different deletions and truncations of CreA. The consv deletion strain also exhibits no impairment of growth and sporulation compared to CreA wild type (WT) strain. The application of random mutagenesis to reduce CCR showed to be challenging, as no muta-tions were induced in the creA gene in mutants selected using a pyrG/hygR CCR reporter. The pyrG/hygR reporter, utilizing the conserved Cre-binding motif 5’-SYGGRG-3’ along with the selection markers pyrG and hph, could be an efficient tool with adjusted and further developed conditions to screen mutants less sensitive to CCR in future. Additionally, this study demon-strates that the expression of a CCR inactive truncation CreA*(1-162) under the inducible, non-CCR repressible, and cost-efficient sucA and bphA promoters of A. niger does not lead to a re-lease in CCR by displacement of native CreA. However, these promoters could be promising for further evaluating the mechanisms of CCR. In conclusion, this study anticipates that a com-bination of various metabolic engineering strategies in strain engineering for bioconversion of plant biomass, could efficiently alleviate CCR with minimal impact on phenotypical develop-ment as well lead to more knowledge about the mechanisms of CCR.
Chitin ist nach Cellulose, das am zweit häufigsten vorkommende Biopolymer auf der Erde und erlangt durch die positiven Eigenschaften seiner Oligomere immer mehr an Aufmerksamkeit in der Industrie. Derzeit werden Chitin-Oligomere rein chemisch mittels starker Säurebehandlung gewonnen. Alternativ können Endo- und Exochitinasen für eine umweltfreundlichere Hydrolyse eingesetzt werden. In dieser Arbeit wurden drei fungale Endochitinasen aus den Ursprungsorganismen Trichoderma harzianum (Chit33-TH), Trichoderma asperellum (Chit36-TA) und Myceliophthora thermophila (Chit46-MT) in Pichia pastoris rekombinant exprimiert, mittels Ni-NTA-Affinitätschromatographie und Dialyse aufgereinigt und biochemisch charakterisiert. Dabei zeigten die Chitinasen maximale spezifische Umsatzgeschwindigkeiten von 16 (Chit33-TH), 50 (Chit36-TA) und 98 nkat/mg (Chit46-MT). Die Endochitinasen hatten nach der Deglykosylierung ein molekulares Gewicht von 33 (Chit33-TH), 36 (Chit36-TA) und 46 kDa (Chit46-MT). Die pH-Optima und Temperaturmaxima lagen für alle drei Enzyme bei einem pH-Wert von 4,5 und 50 °C, zudem waren sie bei 45 bis 50 °C für 15 Minuten temperaturstabil. Detergenzien und Kationen wie Cu2+, Mn2+, Co2+ und Zn2+ hatten einen inhibierenden Effekt ab 1 mM. Höhere Ca2+-Konzentrationen ab 10 mM reduzierten die Enzymaktivität um bis zu 30 %. Eine Produktinhibition mit N-Acetylglucosamin konnte nicht festgestellt werden. Bei allen rekombinanten Enzymen konnte mittels DNS-Assay die Freisetzung von reduzierenden Zuckerenden und somit geeignete Eigenschaften kolloidales Chitin zu wasserlösliche ChitinOligomere umzuwandeln, nachgewiesen werden. Insbesondere Chit46-MT erreichte nach 24 h einen Hydrolysegrad bis zu 96 % und bewies, dass eine enzymatische Hydrolyse für die industrielle Chitin-Oligomerproduktion nutzbar ist.
Die Analytik von Pflanzenkohle ist besonders im Hinblick auf einen möglichen Einsatz in der Landwirtschaft als Düngemittel Ersatz wichtig, da bei der Herstellung krebserregende polyzyklische aromatische Kohlenwasserstoffe (PAK) entstehen. Die PAK-Analytik bietet die Möglichkeit zu überprüfen und zu kontrollieren, wie viel belastetes Material auf diese Weise in die Umwelt eingeführt wird. In dieser Arbeit werden mögliche Methoden zur Extraktion und Analyse im Hinblick auf einen Schnelltest mit der bestehenden Methode bestehend aus Soxhlet-Extraktion und GC-MS Analyse verglichen. Untersucht werden die 16 EPA-PAK. Ein Schnelltest würde den Herstellern von Pflanzenkohle eine günstigere und engmaschigere Überwachung ihrer Produkte bieten.
Für die Extraktion wurden Ultraschallbad, Schüttler und Mikrowelle getestet, sowie verschiedene grüne Lösemittel als mögliche Alternativen zum momentan verwendeten Toluol. Die Extraktion mit 6 h Ultraschallbad hat mit 64% im Verhältnis zur Soxhlet am besten abgeschnitten. Bei dem Vergleich zweier Ultraschallbad-Extrakte mit den Soxhlet-Referenzen wurden jedoch 43 % und 93 % für die Summe der 16 EPA PAK gemessen. Die Methode bedarf also weiterer Untersuchungen.
Für die Analyse wurde HPTLC mit RP-18 Platten und einem Acetonitril-Wasser-Gemisch als mobile Phase getestet. Es wurden drei mögliche Methoden für die Gestaltung eines Schnelltestes getestet, ein Summenpeak mit allen 16 EPA-PAK und Naphthalin oder Benzo[a]pyren als Indikatorsubstanz. Aus diesen Versuchen geht das Standard-Additionsverfahren mit Benzo[a]pyren erfolgreich hervor, da die Ergebnisse durch die GC-MS-Analyse der gleichen Extrakte bestätigt werden konnten. Die Bestimmung von LOD und LOQ bestätigt, dass die Methode empfindlich genug ist, um den nötigen Messbereich erfassen zu können. Es wurden auch Versuche mit Coffein imprägnierten Platten durchgeführt. Diese Methode ist jedoch wegen der notwendigen Zweifachentwicklung deutlich aufwendiger und wurde daher nicht für die quantitativen Versuche gewählt.
Die optimale Zusammensetzung und Aktivität der Mikroorganismengemeinschaft ist für den stabilen und effizienten Betrieb einer Biogasanlage essentiell. Moderne kultivierungsunabhängige Nachweismethoden können erstmals die Basis für eine rationale mikroorganismenfokussierte Verfahrensoptimierung liefern. Als erster Schritt für den Aufbau eines aussagekräftigen Monitoringsystems für die Biogasmikrobiologie wurde ein nucleinsäurebasiertes Verfahren (TaqMan Real-time PCR) zum Nachweis der methanbildenden Mikroorganismen (Archaeen) sowie von vier Untergruppen etabliert und auf Proben aus zwei unterschiedlich betriebenen Biogasanlagen in Neuried und Oberried angewandt. Bei der Anlage in Oberried in der Nähe von Freiburg, betrieben von örtlichen Landwirten (Substrat: Gülle, Grassilage, Maissilage, Mist, Anlage mit Güllevorgrube, Fermenter und Gärrestlager) konnten insgesamt höhere absolute Konzentrationen an Archaeen nachgewiesen werden als in der Anlage in Neuried in der Nähe von Offenburg, betrieben durch die Fa. badenova AG & Co. KG, Freiburg (thermophil betrieben, Substrat: Maissilage, Anlage mit Hauptfermenter, Nachfermenter und Gärrestlager). Auch hinsichtlich der vier untersuchten Untergruppen zeigten sich deutliche Unterschiede, die auf die unterschiedlichen an der Methanbildung beteiligten Abläufe hinweisen.
In contrast to a conventional fuel cell the electrons in a microbial fuel cell (MFC) originate from the metabolic conversion of organic substrates by special bacteria instead of using molecular hydrogen. Recent research in our group has shown that the maximum electrical power density in a MFC correlates with the biomass concentration in batch MFC experiments. In continuous MFC systems additionally the dilution rate D could have an effect on the specific power density. Therefore two steady state conditions are adjusted and the resulting specific power densities, and the biomass and substrate concentrations were measured. These results were implemented in a mathematical description of the continuous MFC-process and the visualization of the model is presented.
Die biologische Verwertung von cellulose-/ hemicellulose- und lignocellulosereichen organischen Substraten zur Erzeugung von Energieträgern gewinnt zunehmend an Bedeutung. Im Gegensatz zu Biokraftstoffen der ersten Generation, bei denen nur ein kleiner Teil des pflanzlichen Materials eingesetzt worden ist (Öl, Zucker, Stärke), wird bei Biokraftstoffen der zweiten Generation fast die vollständige Pflanze einschließlich der schwer zugänglichen Cellulose verwendet. In Biogasanlagen führt diese Zielstellung jedoch häufig zu Problemen. Lignocellulose-reiches Material ist für viele Mikroorganismen schwer oder gar nicht abbaubar. Um die schwer abbaubaren Pflanzenteile wie Cellulose, Hemicellulose oder Lignin den Mikroorganismen in einer Biogasanlage besser zugänglich zu machen, können Biogassubstrate vorbehandelt werden.
Das Ziel dieses Projekts ist die Entwicklung und Charakterisierung einer mikrobiellen Brennstoffzelle (MBZ). Die MBZ unterscheidet sich von einer herkömmlichen Brennstoffzelle darin, dass die an der Anode erzeugten Elektronen nicht vom molekularen Wasserstoff, sondern direkt von der im Anodenkompartiment wachsenden Biomasse aus organischen Verbindungen stammen. Die Funktionsweise einer solchen Zelle ist in Abbildung 3.4-1 dargestellt. Im Gegensatz zur herkömmlichen Brennstoffzelle können in einer MBZ auch Abwasserteilströme z. B. aus der Lebensmittelindustrie als Substrat eingesetzt werden. Der große Vorteil der MBZ besteht somit darin, dass Abwässer biologisch abgebaut und gleichzeitig elektrischer Strom erzeugt werden kann.