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Enzyme‐assisted HPTLC method for the simultaneous analysis of inositol phosphates and phosphate
(2023)
Background
The analysis of myo‐inositol phosphates (InsPx) released by phytases during phytic acid degradation is challenging and time‐consuming, particularly in terms of sample preparation, isomer separation, and detection. However, a fast and robust analysis method is crucial when screening for phytases during protein engineering approaches, which result in a large number of samples, to ensure reliable identification of promising novel enzymes or target variants with improved characteristics, for example, pH range, thermal stability, and phosphate release kinetics.
Results
The simultaneous analysis of several InsPx (InsP1‐InsP4 and InsP5 + 6) as well as free phosphate was established on cellulose HPTLC plates using a buffered mobile phase. Inositol phosphates were subsequently stained using a novel enzyme‐assisted staining procedure. Immobilized InsPx were hydrolyzed by a phytase solution of Quantum® Blueliquid 5G followed by a molybdate reagent derivatization. Resulting blue zones were captured by DAD scan. The method shows good repeatability (intra‐day and intra‐lab) with maximum deviations of the Rf value of 0.01. The HPTLC method was applied to three commercially available phytases at two pH levels relevant to the gastrointestinal tract of poultry (pH 5.5 and pH 3.6) to observe their phytate degradation pattern and thus visualize their InsPx fingerprint.
Conclusion
This HPTLC method presents a semi‐high‐throughput analysis for the simultaneous analysis of phytic acid and the resulting lower inositol phosphates after its enzymatic hydrolysis and is also an effective tool to visualize the InsPx fingerprints and possible accumulations of inositol phosphates.
Die Analytik von Pflanzenkohle ist besonders im Hinblick auf einen möglichen Einsatz in der Landwirtschaft als Düngemittel Ersatz wichtig, da bei der Herstellung krebserregende polyzyklische aromatische Kohlenwasserstoffe (PAK) entstehen. Die PAK-Analytik bietet die Möglichkeit zu überprüfen und zu kontrollieren, wie viel belastetes Material auf diese Weise in die Umwelt eingeführt wird. In dieser Arbeit werden mögliche Methoden zur Extraktion und Analyse im Hinblick auf einen Schnelltest mit der bestehenden Methode bestehend aus Soxhlet-Extraktion und GC-MS Analyse verglichen. Untersucht werden die 16 EPA-PAK. Ein Schnelltest würde den Herstellern von Pflanzenkohle eine günstigere und engmaschigere Überwachung ihrer Produkte bieten.
Für die Extraktion wurden Ultraschallbad, Schüttler und Mikrowelle getestet, sowie verschiedene grüne Lösemittel als mögliche Alternativen zum momentan verwendeten Toluol. Die Extraktion mit 6 h Ultraschallbad hat mit 64% im Verhältnis zur Soxhlet am besten abgeschnitten. Bei dem Vergleich zweier Ultraschallbad-Extrakte mit den Soxhlet-Referenzen wurden jedoch 43 % und 93 % für die Summe der 16 EPA PAK gemessen. Die Methode bedarf also weiterer Untersuchungen.
Für die Analyse wurde HPTLC mit RP-18 Platten und einem Acetonitril-Wasser-Gemisch als mobile Phase getestet. Es wurden drei mögliche Methoden für die Gestaltung eines Schnelltestes getestet, ein Summenpeak mit allen 16 EPA-PAK und Naphthalin oder Benzo[a]pyren als Indikatorsubstanz. Aus diesen Versuchen geht das Standard-Additionsverfahren mit Benzo[a]pyren erfolgreich hervor, da die Ergebnisse durch die GC-MS-Analyse der gleichen Extrakte bestätigt werden konnten. Die Bestimmung von LOD und LOQ bestätigt, dass die Methode empfindlich genug ist, um den nötigen Messbereich erfassen zu können. Es wurden auch Versuche mit Coffein imprägnierten Platten durchgeführt. Diese Methode ist jedoch wegen der notwendigen Zweifachentwicklung deutlich aufwendiger und wurde daher nicht für die quantitativen Versuche gewählt.